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sábado, 30 de julio de 2016

Descifrando el ADN: Vivimos ya en el mundo CRISPR

Perdóname por escribirte una carta tan larga, 
pero es que no he tenido tiempo de hacerla más breve.
De una carta de Marx a Engels.

Inmersos como estamos en ese “achique de espacios” mentales que constituyen las idas y venidas de los procesos electorales, y en esa especie de parto de los montes que es el pacto de investidura, los grandes acontecimientos que van a marcar nuestro futuro apenas ocupan el campo de juego noticiable en los medios de comunicación.

El 20 de diciembre pasado, cuando fuimos partícipes del primer “gatillazo” electoral, la revista Science colocó a la revolucionaria técnica de edición genética conocida como CRISPR,  que permite borrar, introducir o reparar trozos de genes asociados a enfermedades, como el descubrimiento científico más importante de 2015. El pasado 23 de junio, mientras nos preparábamos para  pedalear en esa especie de bicicleta sin cadena que es la jornada de reflexión, un comité de expertos de Estados Unidos daba luz verde al primer ensayo en humanos de la técnica CRISPR para tratar tres tipos de cáncer: mieloma, sarcoma y melanoma. En la última semana de julio, cuando en La Zarzuela aprestaban la pasarela para una segunda e inútil ronda de consultas cuyos previsibles resultados la convertían en una demostración más de que los esfuerzos inútiles conducen a la melancolía, la revista Nature adelantó que China, ganándole por la mano a Estados Unidos, ejecutará el primer ensayo de aplicación de la revolucionaria herramienta contra tumores de pulmón muy agresivos.

Enmanuelle Charpentier (derecha) y Jennifer Doudna
tras recoger el premio Princesa de Asturias
La primera aparición sonada del CRISPR en nuestro país coincidió también con otro proceso electoral. El 25 de mayo de 2015, se celebraban las elecciones autonómicas que darían un vuelco al mapa político de ayuntamientos y comunidades autónomas. Esa semana, el jurado anunció que dos biólogas, una francesa, Emmanuelle Charpentier, y otra estadounidense, Jennifer Doudna, habían ganado el premio Princesa de Asturias de Investigación. Un premio que, me atrevo a pronosticar, les abre el camino del Nobel, porque las investigaciones de ambas, primero por separado y luego en comandita, han desarrollado una tecnología de edición genómica que permite reescribir el genoma y corregir genes defectuosos con un nivel de precisión sin precedentes y de forma muy económica, lo que constituye una revolución biotecnológica de primera. Su trabajo, inspirado en la defensa inmunitaria de las bacterias frente a los virus, abre así una gran esperanza a la terapia génica y al tratamiento de enfermedades, como el cáncer, la fibrosis quística y el Síndrome de Inmunodeficiencia Severa Combinada (la enfermedad de los conocidos como niños burbuja), entre otras.

Y ahora, después de repasar mis adormecidos conocimientos de Genética, trataré de explicar qué diablos es eso de la técnica CRISPR. Los lectores que hayan desdeñado la siempre traicionera lectura en diagonal y se hayan tomado la molestia de haber leído con algún detenimiento el párrafo anterior, habrán notado que he empleado los términos “edición”, “reescribir” y “corregir”, ardid que me pone en el camino de explicarme utilizando como metáfora un procesador de textos.

Representación del código genético
El genoma de un organismo se encuentra en el ADN o, en el caso de algunos virus, en el ARN. La porción de genoma que codifica varias proteínas o un ARN se conoce como gen. El alfabeto que compone los genes en el ADN de todos los seres vivos se compone de tan sólo cuatro letras, que son las iniciales de cuatro bases nitrogenadas distintas: adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C). Las combinaciones de esas cuatro letras conforman palabras y frases de mayor o menor longitud, los genes.  Para seguir entrando en materia, conviene recordar que el genoma humano está contenido en 23 pares de cromosomas y que la secuencia de ADN en el genoma haploide (es decir, en una sola representación por cada par) tiene una longitud total aproximada de 3200 millones de pares de bases de ADN que contienen unos 20.500 genes.

Como recordé en una entrada anterior, el principal problema que enfrentaban los genetistas al trabajar con ADN era la excesiva longitud de esta molécula. Una molécula de ADN humano completamente extendida mide unos cuantos centímetros. A escala humana parece poca cosa, pero comparada con cualquier otra molécula presente en los seres vivos es gigantesca. No se podía avanzar gran cosa en el conocimiento del código genético hasta que se descubrieran las tijeras y el pegamento adecuados para cortarla y unir los trozos sueltos. Primero, en 1967, se descubrió el pegamento, una enzima llamada ADN-ligasa que, como su nombre indica, liga fragmentos de ADN, formando una molécula a partir de dos. En 1970 se descubrieron las tijeras para cortar ADN, una familia de proteínas conocidas como endonucleasas de restricción, cada una de las cuales es capaz de reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortarlo en ese punto en concreto.

El descubrimiento de ambas herramientas, las tijeras (endonucleasas) y el pegamento (ligasas), permitió dar un paso gigantesco en la manipulación del ADN. A partir de ese momento, el desarrollo de la ingeniería genética se volvió tan imparable como lento. Quedaba un gran problema por resolver: el “corta-pega” era un trabajo enormemente tedioso que consumía horas y horas de trabajo rutinario que podrían verse reducidas si alguien con ganas de viajar a Suecia encontraba la técnica adecuada.

En 1983, el bioquímico estadounidense Kary Mullis desarrolló una novedosa técnica de biología molecular -la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)- mediante la cual un pequeño fragmento de ácido nucleico puede clonarse varias veces para obtener copias múltiples, algo que resulta de gran utilidad para investigar la evolución, identificar individuos a partir de cantidades mínimas de tejidos, de sangre o de un simple cabello (algo que sabrán muy bien los seguidores de series como Expediente X o CSI), y para diagnosticar enfermedades genéticas. La técnica se hizo muy popular a raíz de la concesión del Nobel de Química de 1993 a Mullis, de manera que científicos de todo el mundo se pusieron manos a la obra a manipular textos que dejan al que sigue como un juego de parvulario. Intenten descifrarlo:
«yquedeademarcarloslosdementaleslaslosmontesidasnoticiasnuestroocupandedefuturograndesinmersosdededeelelelectoralesenenesesaeseespaciosvanespecieestamosapenasinvestiduraachiqueacontecimientoscampocomocomunicaciónmediosconstituyenjuegolaslospactopartoprocesosquequeyvenidas»
¿Difícil, verdad? Es el primer párrafo de esta entrada, pero con las palabras desordenadas y sin espacios, puntos ni comas. Así está escrito el código genético. Es relativamente sencillo reconocer palabras, porque son combinaciones de 27 letras. Ahora bien. Imagínese que el alfabeto que usa está compuesto por solamente cuatro letras y que las palabras que se forman con ellas, los genes, pueden ser relativamente cortas o tremendamente largas. Por más ligasas, polimerasas y endonucleasas que tuvieran a su disposición los genetistas, descifrar el texto para encontrar un gen entre otros 23.500 no era nada fácil. Por eso, hasta hace poco, intervenir con precisión en el ADN cambiando un simple gen requería mucho tiempo y trabajo.

Tecnologías como las nucleasas con dedos de zinc, una especie de tijeras que permiten seleccionar con precisión la parte de ADN que se pretende manipular, comenzaron a cambiar la situación y ya han mostrado su potencial para combatir infecciones como el sida. Sin embargo, estas técnicas siguen siendo caras y difíciles de utilizar en comparación con el CRISPR, el “Word” de la ingeniería genética, que se aplica sobre el genoma y permite añadir, «suprimir o rectificar varios genes a la vez con tal eficacia y simplicidad, y a tal precio de ganga, que ha puesto la edición del genoma humano al alcance de cualquier laboratorio del ramo».

Aunque estoy seguro de que todos mis lectores saben lo que es un palíndromo, me permito recordarlo. Un palíndromo (no conviene confundirse con palimpsesto ¿verdad que no?) es una palabra o frase cuyas letras están dispuestas de tal manera que resulta la misma leída de izquierda a derecha que de derecha a izquierda. Ejemplos: «anilina», «reconocer», «sometemos» o «dábale arroz a la zorra el abad». Puesto que los idiomas están formados por un determinado número de letras (las que componen su respectivo alfabeto) en todos los idiomas existen palíndromos.

¿Qué por qué introduzco esa esdrújula morcilla? Pues porque CRISPR es un acrónimo en inglés de «Cortas repeticiones palindrómicas agrupadas y espaciadas regularmente». Como explicaron sus descubridores, un equipo de investigación de la Universidad de Alicante dirigido por el biólogo Francis Mojica, se trata de una secuencia de ADN bacteriano muy especial, que contiene tramos cortos que se repiten a intervalos regulares y que se leen igual aunque tengan la orientación invertida.

A diferencia del resto de los españoles, que acuden a Santa Pola a veranear, el biólogo Francis Mojica iba allí a investigar. En 1993, cuando analizaba cómo podía sobrevivir una especie de arquea (unos microorganismos parecidos a las bacterias) en las salinas de la localidad alicantina, le pasó lo que a Fleming con la penicilina, que descubrió por casualidad unas extrañas secuencias que se repetían periódicamente en el ADN microbiano. Las bautizó CRISPR y se decidió a indagar; años después, Mojica, que probablemente sabía que algunos investigadores japoneses y holandeses seguían ya la pista desde hacía años, publicó que aquel sistema natural, capaz de cortar y pegar ADN de manera rápida y eficaz, era una defensa de los microbios para protegerse de los virus.

Francis Mojica
Mojica encontró que una zona determinada del genoma de muchos microorganismos, sobre todo arqueas, estaba llena de repeticiones palindrómicas sin ninguna función aparente. Estas repeticiones estaban separadas entre sí mediante unas secuencias denominadas “espaciadores” que se parecían a otras de virus y plásmidos. Justo delante de esas repeticiones y “espaciadores” hay una secuencia llamada “líder”. Estas secuencias son las que se llamaron CRISPR. Muy cerca de este agrupamiento se podían encontrar unos genes que codificaban para un tipo de nucleasas: los genes cas.

La cosa pasó a mayores en 2007 cuando investigadores de la compañía alimentaria Danisco encontraron que los CRIPRS podían alterar la resistencia de la bacteria Streptococcus termophilus a ataques de bacteriófagos. Las implicaciones económicas eran importantes, dado que S. termophilus es una de las bacterias fundamentales en la producción de yogurt. Esas bacterias tienen unas enzimas que son capaces de distinguir entre el material genético de la bacteria y el del virus y, una vez hecha la distinción, destruyen al material genético del virus.

Las bases de este mecanismo no se conocieron hasta más adelante, cuando se mapearon los genomas de algunas bacterias y otros microorganismos. Trabajando juntas, Charpentier y Doudna se inspiraron en el descubrimiento de Mojica para desarrollar una tecnología, que llamaron CRISPR/Cas9, que permite reescribir cualquier genoma con una precisión sin precedentes. Esa herramienta molecular funciona como unas tijeras que son capaces de cortar cualquier molécula de ADN haciéndolo además de una manera muy precisa y totalmente controlada. Esa capacidad de cortar el ADN es lo que permite modificar su secuencia, eliminando o insertando nuevo ADN.

El sistema tiene dos componentes básicos: un trozo de ARN, el mensajero de la información genética, que sirve de guía para identificar el fragmento de ADN que se quiere editar, y una enzima que lo corta. Esta herramienta tiene su origen en un sistema de defensa de las bacterias, que utilizan el CRISPR para integrar el material genético de los virus que les atacan y guardarlo en su propio ADN para reconocerlo y utilizarlo en una próxima infección.

Cuando un virus entra dentro de la bacteria toma el control de la maquinaria celular y para ello interacciona con distintos componentes celulares. Pero las bacterias que tienen este sistema de defensa poseen un complejo formado por una proteína Cas unida al ARN producido a partir de las secuencias CRISPR. Si el material genético del virus interacciona con ese complejo está perdido: el material genético viral es inactivado y posteriormente degradado. Pero el sistema va más allá. Las proteínas Cas son capaces de coger una pequeña parte del ADN viral, modificarlo e integrarlo dentro del conjunto de secuencias CRISPR. De esa forma, si esa bacteria (o su descendencia) se encuentra con ese mismo virus, ahora inactivará de forma mucho más eficiente al material genético viral. Es, por lo tanto, un verdadero sistema inmune de bacterias que, una vez incorporado, se transmitirá de generación en generación.

En 2012 Charpentier y Doudna dieron el paso clave para convertir esa observación biológica en una herramienta molecular útil en el laboratorio. En agosto de este año publicaron un artículo en la revista Science en el que se demostraba cómo convertir esa maquinaria natural en una herramienta de edición programable, que servía para cortar cualquier cadena de ADN in vitro. Es decir, lograban programar el sistema para que se dirigiera a una posición específica de un ADN cualquiera (no solo vírico) y lo cortara.

¿Cómo se edita el ADN con esta tecnología? Todo comienza con el diseño de una molécula de ARN (CRISPR o ARN guía) que luego será insertada en una célula. Una vez dentro, reconoce el sitio exacto del genoma donde la enzima Cas9 deberá cortar. El proceso de editar un genoma con CRISPR/Cas9 incluye dos etapas. En la primera atapa el ARN guía se asocia con la enzima Cas9. Este ARN guía es específico de una secuencia concreta del ADN, de tal manera que, por las reglas de complementariedad de nucleótidos, se hibridará en la secuencia que interesa editar o corregir. Entonces actúa Cas9, que es una enzima capaz de romper un enlace en la cadena de los ácidos nucleicos, cortando el ADN. Se puede decir que el ARN guía actúa de perro lazarillo llevando a Cas9, el ejecutor, al sitio donde ha de realizar su función.

En la segunda etapa se activan al menos dos mecanismos naturales de reparación del ADN cortado. El primero, llamado Indel (inserción-deleción), hace que, después del sitio de corte (la secuencia específica del ADN donde se unió el ARN guía), aparezca o como un hueco en la cadena, o insertada como un fragmento más de la cadena. Esto conlleva a la perdida de la función original del segmento de ADN cortado. El segundo mecanismo permite la incorporación de una secuencia concreta exactamente en el sitio original de corte. Para eso, lógicamente, hemos de darle a la célula la secuencia que queremos que se integre en el ADN.

Así las cosas, podemos concluir que esta herramienta se podrá utilizar para regular la expresión génica, etiquetar sitios específicos del genoma en células vivas, identificar y modificar funciones de genes y corregir genes defectuosos. Las potencialidades son casi inimaginables. Con la tecnología CRISPR/Cas9 se inaugura una nueva era de ingeniería genética en la que se puede editar, corregir, alterar, el genoma de cualquier célula de una manera fácil, rápida, barata y, sobre todo, altamente precisa. Cambiar el genoma significa cambiar lo esencial de un ser, no lo olviden.

La técnica ya se ha probado con éxito en ratones, monos y perros. Los científicos sueñan ya con las aplicaciones médicas del CRISPR , que permitiría curar enfermedades genéticas en la línea germinal -las células sexuales y sus precursoras- y, por tanto, en los hijos, nietos y toda la descendencia futura del individuo tratado con CRISPR. Esto significaría que no solo se solucionaría su mal, sino que se acabaría con la dolencia en su descendencia. CRISPR es una de las pocas esperanzas reales de curar las 3.000 “enfermedades raras” que, pese a su infrecuencia individual, afligen en conjunto a millones de personas en todo el mundo.

Como concluye Science en la presentación de su hallazgo del año, «para bien o para mal, todos vivimos ya en el mundo CRISPR».